Nome completo Jensen Ross Ackles, nasce a Dallas, in Texas, il 1 marzo 1978, da Roger Alan, un attore, e Donna Joan Shaffer. Ackles ha un fratello maggiore, Joshua, e una sorella minore, Mackenzie. Ha origini irlandesi, inglesi e scozzesi. I suoi genitori lo hanno chiamato Jensen poiché non è un nome comune. Ackles ha giocato a baseball e lacrosse alle scuole superiori. Voleva studiare medicina dello sport ed intraprendere la carriera di fisioterapista, prima di trasferirsi a Los Angeles e diventare un attore. Dopo aver smesso di fare il modello, nel 1996 Ackles cominciò a concentrarsi sulla carriera di attore. Dopo avere fatto molte comparse è entrato nel cast della soap opera Days Of Our Lives nel ruolo di Eric Brady. Nel 1998 vinse il Soap Opera Digest Award come miglior attore giovane e fu nominato per tre volte (nel 1998, nel 1999, e nel 2000) ai Daytime Emmy Award come miglior attore giovane in una serie drammatica per il suo ruolo nella soap opera. Nel 2000, Ackles lasciò Days of Our Lives, e apparì nella mini-serie Blonde sulla vita di Marilyn Monroe. Entra come guest-star nella serie televisiva Dark Angel prodotta da James Cameron, sul network Fox, nel ruolo di Ben/X5-493, lo psicopatico, serial killer "fratello" della protagonista Max, interpretato da una giovane Jessica Alba. Nel 2003 Ackles entrò nel cast della serie televisiva Dawson's Creek sul network The WB durante la sua ultima stagione interpretando il ruolo di C.J., il ragazzo di Jen Lindley. Dopo girò per il network Fox l'episodio pilota di Still Life. Nel 2004 entra nella quarta stagione di Smallville, interpretando il ruolo di Jason Teague, il fidanzato di Lana Lang (Kristin Kreuk). Nel 2005 Ackles ha ottenuto il ruolo di uno dei due fratelli protagonisti della serie televisiva Supernatural per il network The CW, dove recita al fianco di Jared Padalecki.